Strategi terbaik untuk melakukan RT-PCR adalah menyeleksi primer yang mencakup intron, sehingga produk mRNAspesifik PCR dapat diperoleh. Untuk itu, dibutuhkan sekuen genom baik yang lengkap maupun yang sebagian, yang mengindikasikan posisi dari setidaknya satu intron dalam gen. Melakukan pencocokan sekuen antara genom dan cDNA mungkin dapat membantu tujuan ini. Bahkan jika sekuen genom tidak tersedia, wilayah target apapun yang ukurannya memungkinkan di dalam mRNA (300-400 bp) memiliki probabilitas untuk mencakup intron. Hal ini bisa diuji secara empirik dengan melakukan PCR menggunakan genom DNA sebagai template, untuk menentukan apakah produknya lebih besar daripada produk yang diperoleh dari cDNA.
Akhir-akhir ini dalam PCR, primer seringkali diseleksi pada basis secara acak. Primer yang terseleksi dengan cara ini biasanya bekerja sangat baik. Baru-baru ini, program komputer telah didesain untuk dapat memilih primer yang paling efisien di antara sebuah sekuen yang diberikan. Program ini menggabungkan sejumlah pertimbangan yang menentukan pasangan primer yang optimal, yang meliputi:
1. self-compatibility minimal antara kedua primer dalam pasangan atau di antara setiap primer; self-compatibility (menyebabkan dimer atau hairpin loops) dapat menghasilkan kerusakan pada primer dalam jumlah tinggi yang berlangsung pada proses PCR.
2. Primer harus sesuai dengan suhu annealingnya. Jika suhu optimal annealing untuk primer 1 lebih rendah daripada primer 2, PCR mungkin harus dilakukan pada suhu annealing di bawah suhu annealing optimal primer 2.
3. Primer seharusnya punya stabilitas yang baik untuk target sekuennya. Dalam teori, seharusnya ada sebuah gradien peningkatan kekuatan mengikat dari 3' ke 5'. Bahkan ikatan sementara 3' end sebuah primer ke sekuen target yang tidak identik dapat menyebabkan priming menjadi tidak spesifik. Dengan menjaga kekuatan pengikatan pada 3' end tetap rendah, dipercaya bahwa untuk mengikat hanya pada sebuah sekuen target yang cocok secara sempurna, dan afinitas yang lebih kuat dari 5' end akan menjepit primer pada tempatnya.
4. Seharusnya ada perbedaan yang signifikan antara suhu annealing primer terkalkulasi dan suhu annealing untuk produk PCR; hal ini mendukung pengikatan primer pada sekuen targetnya lebih dari produk PCR yang diannealing lagi.
Program ini akan memiliki dan memperbanyak ranking pasangan primer yang potensial. Pilih satu opsi yang paling baik yang mencakup sebuah intron dalam sekuen genom.
Sebuah analisis yang berguna untuk dilakukan pada kasus ini adalah pencarian homolog untuk sekuen primer terpilih pada database sekuen. Hal ini akan mengidentifikasikan sekuen homolog apapun yang primernya juga bisa diamplifikasikan (seperti gen pada keluarga yang kekerabatannya sangat dekat). Beberapa homologi dengan gen lain dapat diterima, terutama jika wilayah homologi itu tidak mengikutsertakan 3' end dari primer; pasangan yang sempurna pada end ini menyebabkan priming yang tidak spesifik, dimana bahkan perbedaan nukleotida tunggal pada 3' end akan mengubahnya, tidak mungkin untuk memprime target tak teridentifikasi. Kecuali kedua primer menunjukkan homologi yang kuat dengan target sekerabat, priming tak spesifik bukan lagi masalah. Keuntungan lain dari pencarian homologi adalah bahwa hal itu dapat mengecek ulang sekuen primer pada versi yang beraneka ragam dari sekuen target. Contohnya, database seringkali mengandung beberapa cDNA dan atau sekuen genom untuk gen spesifik, yang secara bebas didaftarkan oleh laboratorium yang berbeda. Karena sesekali, perbedaan nukleotida tunggal diketahui telah terjadi antara versi terpublikasi yang berbeda pada sekuen gen yang sama, pencarian homolog akan membuktikan apakah primer itu cocok pada semua versi sekuen target yang diketahui.
Salah satu masalah yang potensial untuk dipertimbangkan ketika memilih primer adalah terjadinya processed pseudogenes untuk gen yang diinginkan. Gen tertentu telah memperlihatkan salinan tambahan, berlebihan dalam genom yang sama seperti sekuen mRNA. Sekuen ini bisa merepresentasikan peninggalan evolusi dari sekuen mRNA yang tergabung dalam genom pada beberapa titik melalui aktivitas RT viral. Jika target diketahui memiliki processed pseudogene, bahkan jika primer yang mencakup intron didesain, target itu akan menghasilkan produk dari pseudogene dalam genom DNA terkontaminasi yang ukurannya identik dengan produk mRNA spesifik. Jika sekuen pseudogen diketahui, dimungkinkan untuk mendesain primer yang tidak mengamplifikasi pseudogen. Alternatifnya, genom DNA harus dieliminasi dari preparat RNA.
Sumber:
O'Connell, Joe. 2002. RT-PCR Protocols. Humana Press. New Jersey. 21-22.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar