Peran Telomer dalam Penuaan dan Kanker

Di dalam nukleus sebuah sel, gen kita tersusun atas sepasang molekul untai ganda yang berpilin, yang disebut dengan kromosom. Di ujung kromosom terdapat peregangan DNA yang disebut dengan telomer, yang melindungi data genetik kita, sehingga sel dapat membelah dan mempertahankan beberapa rahasia tentang bagaimana kita menua dan bagaimana kita menderita kanker.

Telomer dapat dianalogikan dengan ujung plastik pada tali sepatu, karena mereka menjaga ujung kromosom dari kerusakan dan pelekatan satu dengan lainnya, sehingga akan menghancurkan informasi genetik organisme.

Meskipun demikian, setiap kali sel membelah, telomer menjadi semakin pendek. Ketika telomer menjadi sangat pendek, sel tidak lagi bisa membelah, sel menjadi inaktif atau menua, atau mati. Proses pemendekan ini diasosiasikan dengan penuaan, kanker dan risiko yang lebih tinggi adalah kematian. Jadi telomer juga dapat dianalogikan dengan sumbu pada bom.

Seperti ujung kromosom yang lain, meliputi gennya, telomer juga merupakan sekuen DNA, rantai kode kimia. Seperti semua DNA, telomere dibuat dari empat basa nukleotida: guanin, adenin, timin, dan sitosin.

Telomer dibuat dari pengulangan sekuen TTAGGG pada satu untai dengan AATCCC pada untai yang lain. Jadi, satu potongan telomer adalah sebuah ulangan yang dibuah dari enam pasangan basa.

Di dalam sel darah putih, panjang telomer rentangnya antara 8.000 pasang basa pada bayi yang baru lahir dan 3.000 pasang basa pada orang dewasa dan sekitar 1.500 pada orang tua (seluruh kromosom memiliki kira-kira 150 juta pasang basa). Setiap kali pembelahan, rata-rata sel kehilangan 30 hingga 200 pasang basa dari ujung telomernya.

Pada kondisi normal, sel dapat membelah hanya sekitar 50 hingga 70 kali, dengan telomer yang semakin pendek hingga sel menjadi mati.

Telomer tidak memendek pada jaringan dimana selnya tidak membelah secara terus-menerus, contohnya pada otot jantung.

Mengapa kromosom memiliki telomer?

Tanpa telomer, bagian utama kromosom – bagian dengan gen yang penting bagi kehidupan – akan menjadi pendek setiap kali sel membelah. Jadi telomer memungkinkan sel untuk membelah tanpa kehilangan gen. pembelahan sel penting untuk menumbuhkan kulit yang baru, darah, tulang dan sel yang lain.

Tanpa telomer, ujung kromosom dapat berfusi dan merusal cetak biru genetik sel, kemungkinan akan menyebabkan malfungsi, kanker atau kematian sel. Karena DNA yang rusak sangat berbahaya, sebuah sel memiliki kemampuan untuk merasakan dan memperbaiki kerusakan kromosom. Tanpa telomer, ujung kromosom akan seperti DNA yang rusak, dan sel akan mencoba untuk memperbaiki sesuatu yang sebelumnya tidak rusak. Hal itu juga akan membuat sel berhenti membelah dan kemudian mati.

Mengapa telomer menjadi pendek setiap kali sebuah sel membelah?

Sebelum sebuah sel dapat membelah, sel menggandakan kromosomnya, sehingga kedua sel baru akan memiliki materi genetik yang identik. Untuk mengganda, sebuah kromosom yang terdiri dari dua untai DNA harus saling melepaskan diri dan berpisah. Sebuah enzim (DNA polymerase) kemudian membaca untai-untai yang ada untuk membangun untai-untai baru. Pembangunan untai-untai baru ini memulai prosesnya dengan bantuan potongan pendek RNA. Ketika setiap untai baru yang saling bersesuaian sudah lengkap, untai ini menjadi lebih pendek dari untai aslinya karena sebuah ruang diperlukan di ujung untuk menempatkan potongan pendek RNA ini. Hal ini seperti seseorang yang menggambar dirinya sendiri ke arah pojok ruangan dan tidak dapat menggambari bagian pojok ruangan.

Telomerase menghambat pemendekan telomer

Sebuah enzim yang dimakan telomerase menambahkan basa di ujung telomer. Pada sel yang muda, telomerase menjaga telomer dari kerusakan yang terlalu besar. Tetapi semakin cepat pembelahan sel, tidak lagi cukup telomerase, sehingga telomer menjadi pendek dan sel menua.

Telomerase tetap aktif pada sperma dan sel telur, yang diteruskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Jika sel reproduksi tidak memiliki telomerase untuk menjaga panjang telomernya, organisme yang memiliki kondisi demikian akan punah.

Telomer dan Kanker

Jika sel semakin mengarahkan pertumbuhannya menjadi kanker, sel tersebut membelah lebih sering dan telomernya menjadi sangat pendek. Jika telomer menjadi lebih pendek, selnya akan mati. Seringkali sel-sel ini lolos dari kematian dengan membuat enzim telomerase, yang mencegah telomer menjadi semakin pendek.

Banyak sel kanker yang menyebabkan pemendekan telomer, termasuk kanker pankreas, kanker tulang, kanker prostat, kanker kandung kemih, kanker paru-paru, kanker ginjal dan kanker kepala dan leher. Mengukur telomerase dapat merupakan cara untuk mendeteksi kanker. Jika ilmuan dapat belajar bagaimana untuk menghentikan telomerase, mereka mungkin dapat mengkentikan kanker dengan membuat sel kanker menua dan mati. Dalam satu eksperimen, para peneliti memblokir aktivitas telomerase di dalam sel kanker payudara dan prostat manusia yang ditumbuhkan di dalam laboratorium, yang mendorong sel tumor untuk mati. Tetapi ada risikonya. Memblokir telomerase dapat mengganggu kesuburan, penyembuhan luka, dan produksi sel-sel darah serta sel pada sistem imun.

Telomer dan Penuaan

Ahli genetik Richad Cawthon dan koleganya di Universitas Utah menemukan bahwa pemendekan telomer diasosiasikan dengan umur yang pendek. Di antara orang-orang yang berusia lebih dari 60 tahun, yang memiliki telomer lebih pendek, 3 kali lebih mungkin untuk mati karena penyakit jantung dan delapan kali lebih mungkin akan mati karena penyakit infeksi.

Ketika pemendekan telomer dikaitkan dengan proses penuaan, belum diketahui apakah pemendekan telomer hanyalah sebuah tanda penuaan – seperti rambut abu-abu – atau sebenarnya memiliki kontribusi pada penuaan.

Jika telomerase membuat sel kanker tidak bisa mati, dapatkah telomerase mencegah sel normal dari penuaan? Dapatkah kita menambah waktu hidup dengan mempertahankan atau memperbarui panjang telomer dengan telomerase? Jika iya, akankah hal itu dapat meningkatkan risiko untuk menderita kanker?

Ilmuan tidak begitu yakin. Tetapi mereka telah berhasil menggunakan telomerase di lab untuk mempertahankan sel manusia membelah lebih dari batas normalnya, dan sel tersebut tidak berubah menjadi sel kanker.

Jika kita menggunakan telomerase untuk meng’abadi’kan sel manusia, mungkin kita bisa memproduksi sel dalam jumlah massal untuk transplantasi, termasuk produksi insulin untuk mengobati diabetes, sel otot untuk menyembuhkan penyakit otot, sel tulang rawan untuk arthritis, dan sel kulit untuk menyembuhkan luka bakar. Persediaan sel manusia yang normal yang tak terbatas di laboratorium juga akan membantu usaha untuk menguji obat yang baru dan terapi gen.

Seberapa besar peran telomer pada proses penuaan?

Beberapa spesies yang dapat hidup dalam waktu lama, seperti misalnya manusia, memiliki telomer yang jauh lebih pendek daripada mencit, yang hidup hanya beberapa tahun. Tidak ada yang tahu mengapa demikian. Tetapi ini adalah bukti bahwa telomer sendiri tidak menentukan waktu hidup.

Penelitian Cawthon menemukan bahwa ketika manusia dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan panjangnya telomer, sebagian yang memiliki telomer lebih panjang, hidup dalam jangka waktu rata-rata 5 tahun tebih lama daripada kelompok yang memiliki telomer pendek. Penelitian ini menyimpulkan bahwa waktu hidup dapat ditingkatkan 5 tahun dengan peningkatan panjang telomer pada orang yang telomernya pendek.

Orang-orang dengan telomer panjang masih dapat mengalami pemendekan telomer semakin mereka menua. Berapa tahun kemungkinan yang dapat ditambahkan ke waktu hidup kita jika pemendekan telomer berhasil dihentikan secara sempurna? Cawthon mempercayai 10 tahun atau bahkan 30 tahun.

Setelah umur 60, risiko kematian menjadi dua kali lipat setiap pertambahan umur 8 tahun. Sehingga seorang yang berumur 68 tahun memiliki kemungkinan mati dua kali lipat lebih besar dibandingkan dengan orang yang berumur 60 tahun. Penelitian Cawthon menemukan bahwa perbedaan pada panjang telomer diperhitungkan hanya 4%. Dan ketika intuisi memberi kita informasi bahwa orang tua memiliki risiko lebih besar untuk mati, hanya 6% yang terjadi karena usia kronologis. Ketika panjang telomer, usia kronologis dan gender dikombinasikan (wanita hidup lebih lama daripada pria), faktor tersebut diperhitungkan sebagai 37% dari variasi pada risiko kematian di atas umur 60. Jadi faktor apa lagi yang 63% menyebabkan kematian?

Penyebab utama penuaan adalah stres oksidatif. Ini menyebabkan kerusakan DNA, protein dan lemak yang disebabkan oleh oksidan, yang merupakan zat yang sangat reaktif yang mengandung oksigen. Oksidan normalnya diproduksi ketika kita bernafas, dan juga merupakan hasil dari pembengkakan, infeksi dan konsumsi alkohol dan juga rokok. Dalam suatu penelitian, ilmuan meletakkan cacing di dalam wadah yang di dalamnya terdapat dua zat yang menetralisir oksidan, dan waktu hidup cacing tersebut meningkat pada rata-rata 44%.

Faktor yang lain dalam penuaan adalah ‘glikasi’. Hal ini terjadi ketika glukosa, gula utama yang kita gunakan sebagai energy, berikatan dengan beberapa dari DNA kita, protein, dan lemak, kemudian meninggalkan molekul-molekul tersebut dalam keadaan tidak lagi memiliki kemampuan untuk bekerja. Masalah ini menjadi semakin buruk jika manusia bertambah tua, menyebabkan jaringan tubuh menjadi malfungsi, sehingga timbul penyakit dan kematian. Glikasi dapat menjelaskan mengapa studi di dalam laboratorium hewan mengindikasikan bahwa pembatasan jumlah konsumsi kalori akan menambah waktu hidup.

Kemungkinan besar stress oksidatif, pemendekan telomer dan usia kronologis – bersama-sama dengan variasi gen – semua menyebabkan penuaan.

Telomer dan penyakit lain

Orang yang mengidap penyakit dyskeratosis congenital memiliki telomer yang memendek lebih cepat daripada orang normal. Orang-orang ini menderita umur dan kematian prematur. Mereka menghadapi risiko yang lebih besar terhadap infeksi, leukimia, dan kanker darah, serta kerusakan intestinum, sirosis pada liver dan fibrosis pada paru-paru, selain itu juga pengerasan pada jaringan paru-paru. Mereka umumnya memiliki rambut abu-abu atau bahkan botak, sulit untuk pemulihan luka, bintik pada kulit, pelunakan tulang dan ketidakmampuan belajar. Telomer mungkin berperan dalam penciptaan kondisi tersebut, karena kondisi tersebut mengikutsertakan jaringan dimana sel sering membelah. Ada beberapa bukti yang mengaitkan pemendekan telomere dengan penyakit Alzhaimer, pengerasan arteri, tekanan darah tinggi dan diabetes tipe II.

Sumber: http://learn.genetics.utah.edu/content/chromosomes/telomeres/

Primer Design

Strategi terbaik untuk melakukan RT-PCR adalah menyeleksi primer yang mencakup intron, sehingga produk mRNAspesifik PCR dapat diperoleh. Untuk itu, dibutuhkan sekuen genom baik yang lengkap maupun yang sebagian, yang mengindikasikan posisi dari setidaknya satu intron dalam gen. Melakukan pencocokan sekuen antara genom dan cDNA mungkin dapat membantu tujuan ini. Bahkan jika sekuen genom tidak tersedia, wilayah target apapun yang ukurannya memungkinkan di dalam mRNA (300-400 bp) memiliki probabilitas untuk mencakup intron. Hal ini bisa diuji secara empirik dengan melakukan PCR menggunakan genom DNA sebagai template, untuk menentukan apakah produknya lebih besar daripada produk yang diperoleh dari cDNA.

Akhir-akhir ini dalam PCR, primer seringkali diseleksi pada basis secara acak. Primer yang terseleksi dengan cara ini biasanya bekerja sangat baik. Baru-baru ini, program komputer telah didesain untuk dapat memilih primer yang paling efisien di antara sebuah sekuen yang diberikan. Program ini menggabungkan sejumlah pertimbangan yang menentukan pasangan primer yang optimal, yang meliputi:

1. self-compatibility minimal antara kedua primer dalam pasangan atau di antara setiap primer; self-compatibility (menyebabkan dimer atau hairpin loops) dapat menghasilkan kerusakan pada primer dalam jumlah tinggi yang berlangsung pada proses PCR.

2. Primer harus sesuai dengan suhu annealingnya. Jika suhu optimal annealing untuk primer 1 lebih rendah daripada primer 2, PCR mungkin harus dilakukan pada suhu annealing di bawah suhu annealing optimal primer 2.

3. Primer seharusnya punya stabilitas yang baik untuk target sekuennya. Dalam teori, seharusnya ada sebuah gradien peningkatan kekuatan mengikat dari 3' ke 5'. Bahkan ikatan sementara 3' end sebuah primer ke sekuen target yang tidak identik dapat menyebabkan priming menjadi tidak spesifik. Dengan menjaga kekuatan pengikatan pada 3' end tetap rendah, dipercaya bahwa untuk mengikat hanya pada sebuah sekuen target yang cocok secara sempurna, dan afinitas yang lebih kuat dari 5' end akan menjepit primer pada tempatnya.

4. Seharusnya ada perbedaan yang signifikan antara suhu annealing primer terkalkulasi dan suhu annealing untuk produk PCR; hal ini mendukung pengikatan primer pada sekuen targetnya lebih dari produk PCR yang diannealing lagi.

Program ini akan memiliki dan memperbanyak ranking pasangan primer yang potensial. Pilih satu opsi yang paling baik yang mencakup sebuah intron dalam sekuen genom.

Sebuah analisis yang berguna untuk dilakukan pada kasus ini adalah pencarian homolog untuk sekuen primer terpilih pada database sekuen. Hal ini akan mengidentifikasikan sekuen homolog apapun yang primernya juga bisa diamplifikasikan (seperti gen pada keluarga yang kekerabatannya sangat dekat). Beberapa homologi dengan gen lain dapat diterima, terutama jika wilayah homologi itu tidak mengikutsertakan 3' end dari primer; pasangan yang sempurna pada end ini menyebabkan priming yang tidak spesifik, dimana bahkan perbedaan nukleotida tunggal pada 3' end akan mengubahnya, tidak mungkin untuk memprime target tak teridentifikasi. Kecuali kedua primer menunjukkan homologi yang kuat dengan target sekerabat, priming tak spesifik bukan lagi masalah. Keuntungan lain dari pencarian homologi adalah bahwa hal itu dapat mengecek ulang sekuen primer pada versi yang beraneka ragam dari sekuen target. Contohnya, database seringkali mengandung beberapa cDNA dan atau sekuen genom untuk gen spesifik, yang secara bebas didaftarkan oleh laboratorium yang berbeda. Karena sesekali, perbedaan nukleotida tunggal diketahui telah terjadi antara versi terpublikasi yang berbeda pada sekuen gen yang sama, pencarian homolog akan membuktikan apakah primer itu cocok pada semua versi sekuen target yang diketahui.

Salah satu masalah yang potensial untuk dipertimbangkan ketika memilih primer adalah terjadinya processed pseudogenes untuk gen yang diinginkan. Gen tertentu telah memperlihatkan salinan tambahan, berlebihan dalam genom yang sama seperti sekuen mRNA. Sekuen ini bisa merepresentasikan peninggalan evolusi dari sekuen mRNA yang tergabung dalam genom pada beberapa titik melalui aktivitas RT viral. Jika target diketahui memiliki processed pseudogene, bahkan jika primer yang mencakup intron didesain, target itu akan menghasilkan produk dari pseudogene dalam genom DNA terkontaminasi yang ukurannya identik dengan produk mRNA spesifik. Jika sekuen pseudogen diketahui, dimungkinkan untuk mendesain primer yang tidak mengamplifikasi pseudogen. Alternatifnya, genom DNA harus dieliminasi dari preparat RNA.


Sumber:
O'Connell, Joe. 2002. RT-PCR Protocols. Humana Press. New Jersey. 21-22.

Biolistic Transformation

Biolistic transformation (particle bombardment) is based on the delivery of DNA into plant cells by high velocity gold or tungsten particles (Sanford, 1988). Because DNA delivery by particle bombardment is a physical process that does not depend on bacteria, it has become a versatile and effective transformation method for many species, particularly monocot plants (Wang and Ge, 2006). Biolistic transformation of embryogenic cultures has led to the production of transgenic tall fescue plants (Chen et al., 2003, 2004; Cho et al., 2000; Hu et al., 2005; Spangenberg et al., 1995; Wang et al., 2003a, 2001). Morphogenic calli or embryogenic suspension cells have been used as ideal targets for biolistic transformation. The chimeric hygromycin phosphotransferase gene (hph) and phosphinothricin acetyltransferase gene (bar) have been used as selectable markers. The integration and expression of an hph gene in transformed cells results in the ability to phosphorylate hygromycin, thus rendering the cells resistant to this antibiotic. Similarly, the expression of a bar gene in transformed cells results in the acetylation of phosphinothricin (PPT) and renders the cells resistant to this herbicide. The use of antibiotic selection provides an advantage for the transformed cells to proliferate and regenerate into plants, because most of the target cells are not transformed. The construction of a chimeric gene requires a promoter, which directs when and where the gene should be expressed. The commonly used promoters include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, rice actin promoter, and maize ubiquitin promoter.

Gene Gun

The gun consists of two 6” x 7” x 10” stainless steel chambers connected to a 2HP vacuum pump. The DNA to be delivered is attached to tiny gold or tungsten balls (1 micrometer in diameter). These balls are put onto a disk that is in the inside of the Gene Gun. A blast of helium at 1000 psi sends the disk shooting forward at approximately 1300 feet per second, roughly the same speed as a bullet leaving a rifle. A screen stops the disk and the tiny gold or tungsten balls are launched towards the target cells. The balls breech the cell membrane and release the DNA particles. The Gene Gun utilizes recombinant DNA technology to incorporate the expression of the delivered genes. The genetically altered cells can be used to make plants that include the desired genetic modification in all of their cells (Voiland et al, 1999).